kabar

IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactoside) minangka analog saka substrat β-galactosidase, sing bisa diinduksi banget.Ing induksi IPTG, inducer bisa mbentuk kompleks karo protein repressor , Supaya konformasi protein repressor diganti, supaya ora bisa digabungake karo gen target, lan gen target ditulis kanthi efisien.Dadi, kepiye konsentrasi IPTG ditemtokake sajrone eksperimen?Apa luwih gedhe luwih apik?
Kaping pisanan, ayo ngerti prinsip induksi IPTG: Operon laktosa E. coli (elemen) ngemot telung gen struktural, Z,Y, lan A, sing ngode β-galactosidase, permease, lan acetyltransferase.lacZ nghidrolisis laktosa dadi glukosa lan galaktosa, utawa dadi allo-lactose;lacY ngidini laktosa ing lingkungan ngliwati membran sel lan lumebu ing sel;lacA nransfer gugus asetil saka asetil-KoA menyang β-galactoside, sing kalebu ngilangi efek toksik.Kajaba iku, ana urutan operasi O, urutan wiwitan P lan gen regulator I. Kode gen I minangka protein repressor sing bisa ngiket posisi O saka urutan operator, supaya operon (meta) ditindhes lan dipateni.Ana uga situs naleni kanggo aktivator gen katabolik protein-CAP naleni situs hulu saka urutan miwiti P. Urutan P, urutan O lan CAP naleni situs bebarengan mujudake wilayah regulasi saka operon lac.Gen pengkode saka telung enzim kasebut diatur dening wilayah pangaturan sing padha kanggo entuk ekspresi produk gen sing terkoordinasi.

Yen ora ana laktosa, lac operon (meta) ana ing kahanan represi.Ing wektu iki, repressor lac sing ditulis dening urutan I ing kontrol urutan promotor PI ngiket urutan O, sing nyegah polimerase RNA saka naleni urutan P lan nyegah wiwitan transkripsi;nalika laktosa ana, lac operon (meta) bisa diinduksi Ing operon (meta) sistem iki, inducer nyata dudu laktosa dhewe.Laktosa mlebu ing sel lan dikatalisis dening β-galaktosidase kanggo diowahi dadi allolactose.Sing terakhir, minangka molekul inducer, ngiket protein repressor lan ngganti konformasi protein, sing ndadékaké disosiasi protein repressor saka urutan O lan transkripsi.Isopropylthiogalactoside (IPTG) nduweni efek sing padha karo allolactose.Iki minangka inducer sing kuat banget, sing ora dimetabolisme dening bakteri lan stabil banget, mula akeh digunakake ing laboratorium.

Kepiye cara nemtokake konsentrasi IPTG sing optimal?Njupuk E. coli minangka conto.
Galur E. coli BL21 sing direkayasa sacara genetis sing ngemot pGEX rekombinan positif (CGRP/msCT) diinokulasi ing medium cair LB sing ngemot 50μg·mL-1 Amp, lan dibudidaya sewengi ing suhu 37°C.Budaya ndhuwur iki inoculated menyang 10 gendul 50mL seger medium Cairan LB ngemot 50μg·mL-1 Amp ing rasio 1:100 kanggo budaya expansion, lan nalika Nilai OD600 ana 0,6 ~ 0,8, IPTG ditambahake menyang konsentrasi final.Iku 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0mmol · L-1.Sawise induksi ing suhu sing padha lan wektu sing padha, 1 ml larutan bakteri dijupuk saka iku, lan sel bakteri diklumpukake kanthi sentrifugasi lan ditindakake SDS-PAGE kanggo nganalisa pengaruh konsentrasi IPTG sing beda ing ekspresi protein, banjur pilih konsentrasi IPTG kanthi ekspresi protein paling gedhe.
Sawise eksperimen, bakal ditemokake yen konsentrasi IPTG ora gedhe banget.Iki amarga IPTG duwe keracunan tartamtu kanggo bakteri.Ngluwihi konsentrasi uga bakal mateni sel;lan umume ngandika, kita ngarep-arep yen protein liyane larut ditulis ing sel, luwih apik, nanging ing akeh kasus nalika konsentrasi IPTG dhuwur banget, jumlah gedhe saka Gawan bakal kawangun.Awak, nanging jumlah protein sing larut mudhun.Mulane, konsentrasi IPTG sing paling cocok asring ora luwih gedhe, nanging luwih murah konsentrasi.
Tujuan induksi lan budidaya galur sing direkayasa sacara genetis yaiku kanggo nambah asil protein target lan nyuda biaya.Ekspresi gen target ora mung kena pengaruh faktor galur dhewe lan ekspresi plasmid, nanging uga kondisi eksternal liyane, kayata konsentrasi inducer, suhu induksi lan wektu induksi.Mula, umume, sadurunge protein sing ora dingerteni diekspresi lan diresiki, luwih becik sinau wektu induksi, suhu lan konsentrasi IPTG supaya bisa milih kahanan sing cocog lan entuk asil eksperimen sing paling apik.